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Decoding early myelopoiesis from dynamics of core endogenous network

https://link.springer.com/article/10.1007/s11427-017-9059-y

从核心内源性网络的动态解析早期髓系发育

十年前，主流的分子生物学家认为从网络角度理解复杂生物现象（如癌症的发生和发展）的动态过程是不可能的，或者在生物学上是缺乏动机的。事实上，即使对于那些决心沿着这一方向探索的人来说，也存在着数值上的困难。然而，七年前，一群中国科学家启动了一个项目，旨在获得肿瘤与网络动力学之间的定量联系，并取得了许多有趣的成果。在本文中，我们希望从另一个角度测试这一想法：正常生物过程与网络动力学之间的联系。我们以早期髓系造血作为生物模型。尽管造血过程中细胞命运多样化的标准路线图已经在实验中得到很好的确立，但其背后的动力学机制却鲜为人知。此外，还存在一些实验上的挑战，例如看似矛盾的造血路线图和细胞命运相互转化事件。

以早期髓系细胞命运决定为出发点，我们从已有充分记录的基因调控和信号传导知识中构建了一个核心分子内源网络。将网络转化为一组动力学方程后，我们通过计算发现了几个结构上稳健的状态。这些状态与已知的细胞表型很好地对应。我们还发现了连接这些稳定状态的中间状态，它们揭示了发育路径——即一个稳定状态如何最有可能转变为另一个稳定状态。这种稳定状态之间的互连网络使得细胞命运自然地组织成一个多稳态景观。因此，髓系细胞表型和标准路线图都可以以一种直接的方式从机制上得到解释。此外，最近的挑战性观察结果也得到了自然的解释。更重要的是，这一景观直观地预测了一组额外的细胞状态和发育路径，包括非顺序性和跨分支的转变，这些都可以通过未来的实验进行验证。

总之，内源网络动力学提供了一个综合的定量框架，用于理解髓系祖细胞的异质性和谱系承诺。

发育方案、早期髓系细胞命运决定、内源网络、稳定状态、过渡状态、景观

很久以前，一些生物学家就开创性地提出，应该可以从网络动力学的角度理解癌症等复杂现象。一个显著的例子是癌症标志性论文（Hanahan和Weinberg，2000）。虽然这些标志被认为是合理的，但网络观点却遭到了强烈的反对，甚至被认为最多是隐喻性的，如果不是错误的话。事实上，人们很快意识到，这样的网络在现在和可预见的未来必然是不完整的。尽管随着越来越多的高通量技术和研究努力，不完整信息问题可能会得到解决，但仍然存在一些关键问题。例如，即使到目前的研究阶段，大多数生物学网络仍然是输入输出型的，这在逻辑上是不完整的。此外，如果从越来越高的高通量数据中获得这些网络，由于缺乏动力学参数信息，也无法建立相应的动力学方程。

在过去的18年里，这些问题得到了认真对待。我们一直认为，从网络角度理解癌症的发生和发展确实是可能的，因此系统地提出了内源网络理论（Ao等，2008）。为了获得最基本的理解，我们推断应该存在一组最小的核心模块和通路，例如（异常的）免疫反应和（异常的）代谢，以及常见的细胞周期和凋亡。虽然基因组不稳定性和非整倍体与癌症密切相关，但我们从机制上证明它们并不重要，这些现象应该可以通过内源网络理论来解释（Ao，2007）。原因很明显：至少在远大于典型细胞周期的时间尺度上，所谓的癌症仍然在生物学上具有功能。即使内源网络理论尚未被主流接受，修订后的癌症标志性论文已经采纳了这些观点（Hanahan和Weinberg，2011）。修订版中新增的重要标志包括：细胞能量代谢失调、避免免疫破坏、基因组不稳定性和突变、肿瘤促进性炎症，其中四个在内源网络理论的建立过程中被讨论过。

在定量方面，近10年来，针对各种特定癌症的网络动力学建模也证明了内源网络方法的基本正确性（Wang等，2016；Yuan等，2016）。一个自然的问题是：如果这是一个普遍的生物学理论，它也应该适用于正常的生物过程。在本文中，我们将这一理论应用于一个实验上已充分确立的过程：特定的造血过程，即髓系细胞的早期发育阶段。

血液中含有多种细胞类型，这些细胞每天在骨髓中生成，并具有快速的更新速率。严格调控的造血发育在建立和维持血液稳态中起着关键作用（Orkin和Zon，2008）。揭示造血过程中的细胞命运决定和协调具有重要意义，有助于阐明恶性或再生障碍性疾病的起源（Tenen，2003；Young等，2008）。从广泛的实验观察中，已经建立了造血发育的标准路线图（支持信息中的图S1）：造血干细胞（HSCs）位于发育流的顶端，其特征是具有持久的自我更新能力；HSCs下游是一系列细胞中间体（也称为祖细胞），它们依次经历逐步的命运限制（Akashi等，2000；Kondo等，1997；Weissman，2000）。具体来说，HSCs产生多能祖细胞（MPPs），MPPs生成两个主要的谱系限制性中间体：共同淋巴祖细胞（CLPs）和共同髓系祖细胞（CMPs）。CLPs失去髓系潜能，但保留形成所有淋巴谱系细胞的能力。CMPs随后发育成更特化的祖细胞，包括巨核细胞/红细胞祖细胞（MEPs）和粒细胞/单核细胞祖细胞（GMPs）。这些双能祖细胞进一步发育成不同的髓系细胞类型：MEPs生成红细胞和巨核细胞，GMPs生成粒细胞和单核细胞。

这一标准路线图强调了造血发育的逐步和分层方式，为理解从干细胞池到多谱系分化的过程提供了一个操作范式（Bryder等，2006）。

尽管这种造血方案在实验上已经得到了很好的确立，但其背后的组织原则却鲜为人知。此外，造血发育的许多方面仍然存在争议。例如，进一步的实验证据导致了对标准路线图的一系列修订，但关于造血的明确共识仍然缺失（Adolfsson等，2005；Yamamoto等，2013）；“重编程”或“跨编程”事件在实验中被广泛观察到，这对发育的分层模型提出了质疑（Graf，2011；Ji等，2013；Riddell等，2014）。在这项工作中，我们寻求对造血发育过程中细胞命运组织的全面和定量理解。

基于基因型通常通过生化反应网络与表型相关的假设，网络模型近年来在揭示生物现象的分子基础方面显示出相当大的潜力（Ao等，2008；Cahan等，2014）。主要使用了两种相反的方法：一种是使用各种生物信息学和统计工具从数据中推断网络；另一种是寻找分子之间的因果关系。沿着后一种方法，我们基于生物系统的显著特性提出了内源分子-细胞网络理论（Ao等，2008；Wang等，2013；Zhu等，2004）。以早期髓系细胞命运决定为例，我们通过整合积累的基因调控和信号传导知识构建了一个核心内源网络。我们对核心网络进行了量化，并获得了一组结构上稳健的状态，包括13个稳定状态和42个不稳定状态。通过与独立的实验观察和数据进行比较，我们发现稳定状态捕捉了早期髓系发育中某些细胞命运的核心特征，例如静止或凋亡的红细胞，而不稳定状态捕捉了细胞中间体（如GMPs和MEPs）的核心特征。稳定状态之间的转变更有可能通过某些不稳定状态发生，进一步的分析表明，这些稳健状态之间的互连与已知的发育路径一致，从而使得不同的细胞命运自然地组织成一个多稳态“景观”（Takahashi和Yamanaka，2015；Waddington，1942；Wright，1932）。

因此，我们获得了一个定量的发育方案来理解早期髓系细胞命运决定，这带来了几个引人注目的结果。首先，定量模型以直接的方式从机制上解释了髓系表型和标准路线图模型。逐步的命运限制可以被设想为细胞从干细胞状态过渡到特化细胞状态的过程，依次通过代表某些细胞中间体的一系列不稳定状态。其次，从景观的角度来看，一些看似矛盾的观察结果是预期的，并且原则上可以整合到一个单一模型中。内源网络动力学一致地解释并整合了几个修订的路线图模型和细胞命运相互转化事件，包括髓系旁路模型（Yamamoto等，2013）、巨核细胞偏向模型（LMPP模型的对立模型）（Sanjuan-Pla等，2013）以及特定基因操作下的髓系转分化事件（Graf，2002）。第三，内源网络动力学预测了额外的细胞中间体和发育路径的存在，包括非顺序性和跨分支的转变，这些可以通过未来的实验进行验证。

总之，本定量模型提供了对髓系细胞命运硬连线的全面理解，并提出了一个比以往认为更为复杂的发育图景。

早期髓系细胞命运决定的核心内源网络

造血是一个高度协调的发育过程，其中细胞命运选择（包括自我更新、细胞死亡、代谢和谱系特化）受到严格调控，以维持血液系统的稳态（Folmes等，2012；Orkin和Zon，2008；Weissman，2000；Zhao和Li，2015）。以早期髓系细胞命运决定为例，我们通过整合已有充分记录的知识构建了一个核心内源网络，以揭示其背后的分子基础。内源网络被定义为经过数百万年进化形成的分子-细胞网络，其核心结构和主要特性是保守的（Ao等，2008；Wang等，2013；Yuan等，2017）。我们选择了一组基本模块，包括细胞周期、代谢、凋亡和分化，以捕捉早期髓系发育的核心特征。根据已有充分记录的基因调控和信号传导知识（Alberts等，2008），每个模块被简化并由一组关键代理指定，以捕捉主要功能状态（支持信息中的表S1和S2）。代理之间的相互作用从具有坚实生化基础的基因调控和信号传导中总结而来（支持信息中的表S3）。鉴于反馈调控在生物系统中的普遍存在和重要性（Thomas等，1995），网络被组织为闭合形式。

因此，我们构建了一个早期髓系细胞命运决定的核心内源网络，其中包括45个代理和177个相互作用（图1）。必须承认，核心内源网络中的许多细节已被简化。事实上，参与早期髓系发育的功能模块远不止上述四个模块；大量代理尚未包含在当前的模型中。然而，我们将在接下来的部分中展示，尽管存在这种简化，该核心网络的动力学已经能够捕捉早期髓系发育的核心特征，并提供一系列明确的预测。

定量分析为揭示复杂系统的涌现特性提供了无与伦比的精确性，而这些特性仅凭直觉或线性推理难以理解（Qian，2013）。因此，核心内源网络进一步通过非线性动力系统进行定量描述。计算并分析了固定点，即系统在无扰动情况下保持静止的状态。从数学上讲，固定点分为两类：**稳定状态**，其特征是雅可比矩阵实部的所有特征值为负；**不稳定状态**，其特征是雅可比矩阵实部至少有一个特征值为正（Arnold和Levi，1988）。在稳定状态下，系统对小扰动不敏感，并在小扰动发生时倾向于返回初始稳定状态；而在不稳定状态下，系统更为敏感，会在扰动下演化到某些稳定状态。从景观的角度来看，稳定状态可以直观地视为“盆地”，而不稳定状态则可以视为相邻盆地之间的“峰”或“鞍点”（图2A和B）。稳定状态之间的转变更有可能通过某些不稳定状态发生。因此，雅可比矩阵实部具有单一正特征值的不稳定状态（通常称为鞍点）被定义为**过渡状态**（一级）。雅可比矩阵实部具有n（n≥2）个正特征值的不稳定状态被定义为**n级超过渡状态**。

具体而言，核心内源网络通过一组常微分方程（ODEs）描述。由于代理相互作用的许多详细机制和参数仍未知，我们在模型可处理性和细节之间进行了权衡，并使用了无量纲建模框架，将代理值归一化到0到1之间。“0”表示完全失活，而“1”表示完全激活。在此，我们主要关注固定点，而动力系统的某些更复杂特征（如极限环）在现阶段不详细讨论。我们得到了一个显著的结果：当以0.5为阈值将每个代理分类为激活或失活（表示为1/0）时，使用不同的方程形式或参数值（支持信息中的表S4），13个稳定状态（支持信息中的表S5?S16，S34）和42个不稳定状态（支持信息中的表S17?S20，S35?S38）稳健存在。阈值可以在0.3到0.7之间选择，这不会影响主要结论。为了检查建模的内部一致性，核心内源网络进一步通过布尔动力学近似（支持信息中的补充2.2）。获得了13个稳定状态（支持信息中的表S21），这些状态与ODE动力系统中获得的稳定状态完全一致。我们在其他地方已经证明，通过ODE找到的固定点将对应于随机微分方程（SDEs）中的固定点，这是通过一种新的随机积分实现的（Tang等，2014a，b；Tang等，2014c；Yuan和Ao，2012）。结果表明，这些状态是由内源网络的拓扑结构决定的，而不是由所选的方程形式或参数值决定的。内源网络动力学多稳定性的统计显著性也得到了检验（图2C）。

稳健的稳定状态再现了某些细胞命运的核心特征

稳定状态的概念已被广泛用于表示稳定的细胞表型（Ao等，2008；Huang等，2009；Wang等，2013）。我们从模块层面分析了核心内源网络生成的每个稳定状态的生物学意义。每个状态中的细胞周期、凋亡、代谢和分化模块的状态由代理值指定（模型和方法，支持信息中的补充3.1）。具体而言，细胞周期和凋亡的状态被描述为“开启”或“关闭”，而代谢状态被描述为“有氧”或“无氧”。分化模块的状态由一组激活/高表达的谱系特异性转录因子（TFs）指定。由于分化模块中谱系特异性TFs的表达是每种细胞类型的分子标识（Laiosa等，2006；Rosenbauer和Tenen，2007），13个稳定状态根据其分化模块状态被分为六组（G1-G6）（表1）。

在标准路线图（Akashi等，2000）中，早期髓系发育中存在五种稳定的细胞类型，包括造血干细胞（HSCs）、中性粒细胞（粒细胞）、单核细胞、红细胞和巨核细胞（支持信息中的图S1）。这五种细胞类型的功能状态从已有充分记录的实验观察中总结而来（表2A）。具体而言，HSCs的特征包括其持久的自我更新能力、对细胞死亡的抵抗以及无氧代谢以补充能量（Kohli和Passegué，2014；Weissman，2000）。HSCs的出现和维持需要一系列特定转录因子（TFs）的激活，例如GATA2（Grass等，2006）。在此背景下，HSCs的模块状态被描述为细胞周期“开启”、凋亡“关闭”、无氧代谢以及分化模块中高表达的GATA2，而没有其他谱系特异性TFs的表达。类似地，早期定型阶段的四种特化细胞类型（包括中性粒细胞、单核细胞、红细胞和巨核细胞）也在模块层面进行了特征描述（表2A）。

将模型结果与实验观察在模块层面进行比较时，我们发现五组稳定状态（G1?G5）的分化模块状态分别捕捉了HSCs、中性粒细胞、单核细胞、红细胞和巨核细胞的分子标识（表1和表2A，支持信息中的补充3.2）。我们进一步根据细胞周期、凋亡和代谢的模块状态对每组中的稳定状态进行了分析。结果表明，稳定状态N2、N4、N6、N8和N10分别与HSCs、中性粒细胞、单核细胞、红细胞和巨核细胞的功能状态高度一致。稳定状态N1描述了具有免疫反应的增殖性干细胞样细胞（支持信息中的补充3.2详细说明），这些细胞通常在一些生理过程（如炎症或癌变）中被观察到（Coussens和Werb，2002）。稳定状态N3描述了静止的干细胞。稳定状态N5、N7、N9和N11分别描述了中性粒细胞、单核细胞、红细胞和巨核细胞的凋亡状态。此外，我们在第6组中发现了两个高表达GATA-2、C/EBPs和Gfi-1的稳健稳定状态，这可能代表其他髓系细胞命运（Iwasaki等，2006）。

进一步，我们在分子层面验证了初步结论。首先，我们将稳定状态N2、N4、N6、N8和N10的代理值（分别描述HSCs、中性粒细胞、单核细胞、红细胞和巨核细胞的功能状态）与已发表数据集中这五种细胞类型的人类基因表达数据（Novershtern等，2011）进行了比较。模型结果与实验数据的一致性超过60%（图3A，模型和方法）。考虑到核心内源网络的保守性，我们进一步将模型结果与从小鼠收集的造血表达数据集（Chambers等，2007）进行了比较，结果也显示出良好的一致性（图3B）。需要强调的是，稳健状态是通过计算核心内源网络获得的，而该网络是从独立的基因调控和信号传导知识中构建的。这些稳健状态的涌现模式是内源网络动力学的意外结果，而不是其输入。鉴于实验测量的有限准确性以及我们网络构建中的简化，结果表明模型结果与表达数据之间具有良好的一致性。

过渡状态再现了细胞中间体的核心特征

由于稳健稳定状态与不同细胞命运之间的对应关系已经建立，进一步的问题自然产生：如何解释髓系发育中细胞中间体的存在？这些细胞中间体在以下三个生物学方面与稳定细胞类型有显著不同（Kondo等，2003）。首先，干细胞在最终发育为特化细胞类型之前会经历一系列中间阶段。其次，细胞中间体对外在或内在波动敏感。在波动作用下，这些细胞中间体可以发育为某些细胞类型。第三，细胞中间体的特征是其向特定细胞类型分化的潜力。从数学上讲，动力系统暗示了其理论对应物——不稳定状态的存在（Arnold和Levi，1988）。首先，当系统从一个稳定状态过渡到另一个稳定状态时，更有可能通过某些不稳定状态。其次，与稳定状态相比，不稳定状态对小扰动更敏感。在特定扰动下，系统会离开初始状态并演化到某些稳定状态。第三，一个不稳定状态连接一组特定的稳定状态。这些细胞中间体与不稳定状态之间的相似特性表明，核心内源网络的结构稳健不稳定状态可能具有作为细胞中间体的生物学意义。

从生物学角度来看，根据积累的实验观察，总结了髓系发育中出现的GMPs（粒细胞/单核细胞祖细胞）和MEPs（巨核细胞/红细胞祖细胞）的功能状态。GMPs和MEPs通常以低自我更新能力、对细胞死亡的抵抗以及有氧代谢供应能量为特征（Kohli和Passegué，2014；Kondo等，2003）。GMPs和MEPs中特异性表达的转录因子（TFs）被总结为其分化模块状态（支持信息中的图S1）（Laslo等，2006；Starck等，2003）。在此背景下，GMPs和MEPs的功能状态被描述为细胞周期“关闭”、凋亡“关闭”、有氧代谢以及作为其分子标识的共表达TFs（表3）。

从数学上讲，在ODE动力系统中获得了42个稳健的不稳定状态（支持信息中的表S17?S20）。类似地，在模块层面讨论了这42个不稳定状态的生物学意义（支持信息中的补充4）。由于谱系特异性TFs是特定细胞类型的分子标识，这42个稳健不稳定状态根据其分化模块状态被分为10个子类（C1?C10）（支持信息中的表S22?S30）。我们发现，两个不稳定状态（C1中的U1和C2中的U6）在模块层面分别与GMP和MEP完美匹配（表3）。此外，我们通过比较U1和U6的代理值与人类表达谱数据集（Novershtern等，2011）中GMPs和MEPs的表达数据，在分子层面验证了这一结论。模型结果与实验数据的一致性超过70%（图3C），这表明不稳定状态U1和U6在分子层面分别对应于GMPs和MEPs。除了上述讨论的两个稳健不稳定状态外，模型中还发现了另外40个稳健不稳定状态（支持信息中的表S22?S30，补充4.2）。

简而言之，核心内源网络的稳健不稳定状态U1和U6分别在模块和分子层面对应于GMP和MEP。这两个案例验证了内源网络的结构稳健不稳定状态描述早期髓系发育中细胞中间体的假设。

稳健状态之间的互连指示了发育路径

我们已经表明，内源网络的稳健稳定状态代表特定的髓系细胞命运，而不稳定状态代表细胞中间体。从数学上讲，一个不稳定状态连接一组特定的稳定状态。有趣的是，这些状态之间的互连是否也具有某些生物学意义。

我们设计了一种算法，以获取从每个不稳定状态到其连接的稳定状态的轨迹（模型和方法）。如上所述，我们发现两个不稳定状态U1和U6分别在模块和分子层面对应于GMP和MEP。根据扰动模拟结果，我们发现U1连接了代表中性粒细胞和单核细胞的稳定状态N4和N6，而U6连接了代表红细胞和巨核细胞的稳定状态N8和N10。这些结果与已知的关于GMPs和MEPs分化潜力的实验事实完全一致（Akashi等，2000）。换句话说，结果表明这些稳健状态之间的互连揭示了发育路径，从而使得某些细胞命运能够组织成一个定量动力学框架，以理解髓系发育。

景观作为理解早期髓系发育的定量方案

根据模型结果，我们获得了一个特定的景观模型，作为理解早期髓系发育的定量方案，其中结构稳健的状态对应于细胞表型，它们的互连揭示了发育路径（图4）。它不仅一致地解释了已知的实验观察，还提供了一系列新的预测，这些预测可以通过进一步的实验进行验证。

首先，景观模型直接再现了标准路线图模型。逐步的命运限制被描述为系统（或细胞）克服障碍并从某些干细胞样状态到达超过渡状态，然后依次通过某些较低级别的不稳定状态，最终到达特化细胞状态的过程（图5A和B）。扰动结果表明，超过渡状态比过渡状态倾向于连接更多的稳定状态（支持信息中的表S58?S63）。因此，逐步的细胞命运限制可以通过沿路径连接的不稳定状态所连接的稳定状态的减少来说明。此外，沿发育路径的分子动力学可以从模型结果中预测。内源网络再现了标准模型中的连续动态事件，包括自我更新能力的丧失、多谱系启动事件和逐步的谱系特化，这些与已知事实完全一致（图5C）。

其次，由于景观模型表明从一个稳定状态过渡到另一个稳定状态时存在多条轨迹，因此发育路径的多样化观察结果是预期的（支持信息中的图S2A）。髓系旁路模型（Yamamoto等，2013）在当前景观中得到了直接解释（图6A和B）。巨核细胞偏向模型（Sanjuan-Pla等，2013；Shin等，2014），作为LMPP模型的对立模型（Adolfsson等，2005），也在当前的定量方案中得到了再现（图6C和D）。我们进一步预测了实现巨核细胞偏向发育的多条路径（支持信息中的表S31）。另一方面，由于稳定状态之间的转变是相互转换的，细胞命运相互转换的观察结果可以在景观中得到直接解释（支持信息中的图S2B）。具体而言，我们从内源网络的状态转变动力学中解释了特定基因操作下的髓系转分化（表4）。我们进一步预测了实验中这些转分化事件沿线的分子动力学（图7）。原则上，造血发育的多样化观察结果可以整合到一个单一的景观中。

更重要的是，定量模型展示了细胞状态和发育路径的预测能力，这些可能在之前的实验中未被注意到。我们总共发现了55个结构稳健的状态，包括13个稳定状态和42个不稳定状态，这些状态由网络拓扑决定。在此，我们将基于以下两个具体预测进行讨论：

预测1：非顺序性转变

我们发现一组过渡状态（U14、U16、U17、U19、U20、U21、U23、U24、U25）直接连接了代表干细胞和特化细胞类型的两个稳定状态（图8A，支持信息中的表S31）。这些过渡状态的分化模块状态对应于相关特化细胞类型的分子标识。例如，过渡状态U19连接了代表静止干细胞的稳定状态N3和代表红细胞的稳定状态N8。U19的分化模块状态对应于红细胞的分子标识（Laslo等，2006；Starck等，2003）。因此，我们预测存在一系列细胞中间体，这些中间体不仅具有干细胞样潜能，还具有强烈的向特化细胞类型分化的倾向。这些发育路径暂时被称为**非顺序性转变**，通过这些路径，干细胞可能跳过一些常见的中间状态，直接定型为某些细胞命运（图8B）。

令人鼓舞的是，在我们获得这些预测后，一系列基于单细胞分析的研究相继发表，并将逐步模型修订为具有早期细胞命运定型的路线图（Haas等，2015；Notta等，2016；Paul等，2015；Perié等，2015）。其中，单细胞转录组数据分析展示了早期髓系祖细胞中不同细胞命运的早期转录启动，这些祖细胞可以根据其富集的谱系特异性标记物和转录因子（TFs）分为若干亚组（Paul等，2015）。我们将单细胞基因表达数据（簇C2、C8、C15和C9分别代表红细胞、巨核细胞、单核细胞和中性粒细胞的标记物和TFs）与模型中预测的过渡状态（U21、U24、U17、U14）的代理值进行了比较。单细胞转录数据与模型预测显示出良好的一致性（图9）。单细胞转录数据独立验证了模型预测结果。我们的模型结果也从机制角度支持了这些实验努力。我们进一步预测了这些谱系偏向祖细胞内部的异质性，这些预测可以通过未来的实验进行验证。

我们发现了另一组过渡状态（U39、U40、U41、U42），它们直接连接了代表不同分支中特化细胞类型的两个稳定状态（图8C，支持信息中的表S32）。例如，过渡状态U42连接了代表中性粒细胞和巨核细胞的稳定状态N4和N8。这些过渡状态表明这些“发育上较远”的细胞类型之间存在共同的双能祖细胞。因此，我们预测了通向这些细胞类型的跨分支路径，这些路径突出了造血发育的非层级性和灵活性特征（图8D）。

据我们所知，预测的跨分支转变尚未在实验中被注意到。然而，在特定基因操作下，观察到“远距离”细胞类型之间的转分化，而无需通过共同祖细胞（Graf，2011；Ladewig等，2013）。这些事件间接证明了跨分支转变的存在。需要进一步的实验努力来验证这些预测，例如识别具有向不同分支分化潜力的细胞中间体，以及跨分支发育路径的存在。

经典定义的早期髓系祖细胞内部的异质性以及细胞命运相互转化事件对路线图模型提出了挑战，这使得随着不断的新发现，模型难以持续更新。在本研究中，我们建立了一个早期髓系发育的综合定量框架，不仅从机制角度解释了已知的实验观察，还提供了一系列可通过未来实验验证的预测。我们通过整合独立于积累的机制知识的分子相互作用，构建了一个早期髓系细胞命运决定的核心内源网络。核心内源网络的结构稳健固定点被获得，这些固定点中的代理值在分析之前并不明显，尤其是在如此高维和非线性的动力系统中。尽管在初始阶段核心内源网络中的许多细节已被简化，但这些稳健固定点已经能够再现早期髓系发育中不同细胞状态的主要特征。进一步的分析揭示了这些稳定状态和不稳定状态之间的互连，从而使得某些细胞命运自然地组织成一个景观。

据我们所知，当前的景观模型是第一个定量方案，它（i）从机制角度解释了早期髓系发育的细胞表型和标准方案；（ii）能够解释看似矛盾的观察结果，包括多样化的发育路径和细胞命运相互转化事件；（iii）预测了一组复杂的细胞中间体和发育路径，这些可以通过实验进一步验证。总体而言，这一定量方案提出了比以往认为更为复杂的髓系发育图景，并对发育的线性和层级观点提出了挑战。该定量方案具有进一步扩展的潜力，以解释和预测造血的更多特征，并为造血的进一步调控策略做出贡献。

内源网络与基因调控网络（GRNs）的比较

内源网络旨在捕捉早期髓系细胞命运决定过程的核心分子机制。与此同时，基于生物信息学获得的基因调控网络（GRNs）也以类似的目标被构建（Klein等，2015；Klimmeck等，2014；Novershtern等，2011）。核心内源网络与这些生物信息学获得的GRNs之间的差异主要体现在以下三个方面：

1. **构建方法**：内源网络通过总结已有充分记录的分子生物学和生化实验构建，而生物信息学获得的GRNs则基于高通量数据的统计分析。GRNs的可靠性受限于可用高通量数据的质量和数量（Brenner，2010）。

2. **网络性质**：核心内源网络是一个因果网络，可以进一步定量实现为非线性动力系统（Li等，2015；Wang等，2014a；Wang等，2013；Zhu等，2015）。相比之下，大多数数据驱动的GRNs目前是相关性的网络。

3. **内容范围**：内源网络整合了生物系统中的基因调控和信号传导。

总体而言，这两种方法从不同方向研究了基因型-表型映射：**反向方法**基于相关分子行为识别分子相互作用网络，而**正向方法**则通过已知组件的相互作用研究功能特性的机制。这两种不同方法的共同目标是“中间突破”，以更好地理解支撑这些复杂现象的组织原则。这两种方法的结合具有广阔的前景，将推动生物学进入下一个系统层次。

其他在构建过程中引入已有知识的网络也被提出，用于研究造血系统的分子机制（Kueh和Rothenberg，2012；Naldi等，2010）。内源网络与这些网络的差异如下：

1. **反馈调控**：内源网络在构建中注意到生物系统中反馈调控的普遍存在和重要性，从而形成了一个自主系统。而许多基于已有知识的网络（如KEGG中的网络）是输入输出型的。

2. **功能模块**：内源网络整合了四个功能独立的模块，包括细胞周期、凋亡、代谢和分化。细胞增殖、细胞死亡、代谢和分化之间的交叉调控为血液稳态维持的分子机制提供了全面的理解。

总之，内源网络通过其独特的构建方法和综合视角，为理解早期髓系发育提供了一个强有力的定量框架，并为未来的实验和理论研究提供了新的方向。

对细胞命运决定过程的全面理解

景观的概念早在几十年前就被提出（Waddington，1942；Waddington，2014），作为一种强大的工具，定量和隐喻地描述复杂的生物系统（Ao，2009）。基因和表观遗传效应对表型转变的影响已被广泛讨论（Lei等，2014；Li等，2016；Wang等，2014b）。稳定状态曾被用于表示不同的细胞类型（Ao等，2008；Huang等，2009）。细胞和细胞中间体都被视为稳定状态，而造血发育被设想为一条崎岖的道路，通过一系列“盆地”进行（Enver等，2009）。

在本研究中，我们发现特定网络的稳健稳定状态描述了某些髓系细胞命运。我们提出并验证了结构稳健的不稳定状态代表细胞中间体。两个不稳定状态U1和U6分别在模块状态、基因表达模式和分化潜力方面对应于GMP和MEP。这些不稳定状态的动力学特性为细胞中间体的特殊特征提供了见解，这将有助于阐明祖细胞的调控策略。此外，不稳定状态的敏感性也为最近的小鼠原位追踪实验提供了可能的解释，这些实验表明，在成年期的大部分时间里，祖细胞而非HSCs是稳态造血的主要驱动者（Busch等，2015；Sun等，2014）。内源网络动力学可以指导特定细胞命运的定向操控，并有助于更好地理解正常的血液分化程序，这对于揭示血液系统疾病的起源和进一步推动医学进步至关重要。

构建早期髓系细胞命运决定核心内源网络的主要方法如下。由于生物系统的复杂性，在初始阶段难以描绘每一个细节，因此我们专注于描述保守的调控结构和早期髓系发育的核心特征，而不是试图整合所有积累的调控机制。详细信息见支持信息中的补充部分1。

1. **模块选择**：选择了四个基本模块，包括细胞周期、代谢、凋亡和分化，以捕捉早期髓系发育的主要特征。

2. **关键代理简化**：根据积累的分子知识（Alberts等，2008），每个模块通过一组关键代理简化，以捕捉核心功能状态（支持信息中的表S1和S2）。在本研究中，我们选择了一组基本蛋白质来描述其核心调控结构，因为蛋白质是生物功能的主要执行者。以细胞周期为例，细胞周期的两个间隙期（G1和G2期）为细胞提供了监测内外环境的时间，以确保在细胞决定分裂之前条件适宜（Hartwell和Kastan，1994；Massagué，2004）。其中，G1期在这方面尤为重要。因此，我们选择了G1期限制点（R点）的关键调控因子，包括Cyclin D-CDK4/6复合物、Cyclin E-CDK2、pRb、E2Fs和p21，以代表细胞周期的核心调控机制。通过这种方式，我们将细胞周期近似为双稳态，并主要关注在粗粒度的定量框架中描述细胞周期的“开启”和“关闭”状态。细胞周期的简化已在先前的定量研究中使用（Chen等，2000；Qu等，2003）。这些选择的代理以其进化保守性为特征。

3. **反馈调控**：内源网络的构建强调了生物系统中反馈回路的重要性，从而形成了一个自主系统。

内源网络的定量分析

核心内源网络通过一组常微分方程（ODEs）和布尔动力学分别进行量化和分析。

1. **ODE动力学**：核心内源网络首先通过一组ODEs描述（Ao等，2010；Glass和Kauffman，1973）。采用S形Hill函数来模拟转录调控和信号传导（Huang和Ferrell，1996；von Dassow等，2000），以描述代理之间的激活/抑制关系。设计了两种独立算法来寻找这些动力系统中的结构稳健状态。详细信息见支持信息中的补充部分2.1。

2. **布尔动力学**：在布尔网络中，每个代理的表达被近似为两种状态：激活和失活（用1/0表示）。值在离散时间步长中更新。单个代理的状态变化由布尔规则f指定，这些规则通过布尔逻辑函数（AND、OR和NOT）从网络结构转换而来。设计了算法来计算布尔动力系统的稳定状态。详细信息见支持信息中的补充部分2.2。

设计了算法以获取从每个不稳定状态到其相关稳定状态的轨迹。当系统处于某个不稳定状态时，我们用小的随机向量扰动系统，并获取从每个不稳定状态到连接稳定状态的轨迹。我们记录了每个不稳定状态连接的稳定状态和演化轨迹（支持信息中的表S18?S21）。详细信息见支持信息中的补充2.3。

我们生成了超过10,000个随机网络，其中代理数量和相互作用是固定的。我们使用布尔分析对网络进行了量化，并计算了每个随机网络中的稳定状态数量Qstable。我们将得到的分布与内源网络产生的稳定状态数量进行了比较。对于内源网络，我们发现，而对于所有随机网络，我们发现。在单尾测试中，可以计算P值作为从随机网络观察到13个或更多稳定状态的概率。假设稳定状态的数量符合正态分布，我们进一步使用学生t检验来计算稳定状态数量的P值。

结构稳健状态的模块分析

细胞周期、凋亡、代谢和分化的状态由每个模块中的代理值指定。相应地，讨论了每个状态的生物学意义。基于分化模块的状态，将稳健状态分类为不同的组或子类。详细信息在支持信息的补充部分3中有详细阐述。

与基因分析数据的比较

我们利用两个独立的已发表数据集（分别从人类和小鼠收集，Chambers等人，2007年；Novershtern等人，2011年）在表达水平上验证了模型结果。我们设定了一个阈值来找出每个基因的“开启”或“关闭”状态，并与模型结果中的相应状态进行了比较，其中代理值可以近似为激活或失活（显示为1/0）。详细信息可在支持信息的补充部分5中查看。验证模型结果的数据集可在http://ncbi.nlm.nih.gov/geo/上找到，GSE24759和GSE6506。

原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s11427-017-9059-y

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